萊克多巴胺（Rac）定量檢測試劑盒（ELISA）

使用說明書

一、概要

β興奮劑是一種人和獸醫(yī)作為治療哮喘的藥物。在牲畜中超劑量使用可以脂肪組織轉(zhuǎn)化為肌肉組織，由于能夠顯著改善脂肪率和生產(chǎn)效率，β興奮劑往往被濫用于畜牧養(yǎng)殖生產(chǎn)中。已經(jīng)有克倫特羅或其他β興奮劑中毒的病例報道，近來又有一些非法使用萊克多巴胺（Rac）來替代克倫特羅作為飼料添加，并存在濫用現(xiàn)象。

通常情況下，HPLC或GC-MS是克倫特羅殘留檢測的確證方法，但是其前處理步驟繁瑣、費(fèi)用昂貴。酶聯(lián)免疫快速檢測試劑盒具有成本低廉、操作簡便、一次處理樣本量大等優(yōu)點，已成為常規(guī)的初步篩查方法。本試劑盒是應(yīng)用ELISA技術(shù)研發(fā)的新一代藥物殘留檢測產(chǎn)品，與儀器分析技術(shù)相比具有快速、簡便、準(zhǔn)確和靈敏度高等特點，能zui大限度地減少操作誤差和工作強(qiáng)度。

二、用途

定量檢測動物尿液中萊克多巴胺（Rac）的殘留。

三、檢測原理

本試劑盒采用競爭酶聯(lián)免疫試驗。檢測的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)，微孔板預(yù)包被羊抗鼠IgG捕獲抗體，加入鼠抗萊克多巴胺抗體后，會與捕獲抗體連接。經(jīng)過孵育及洗板后，加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品及萊克多巴胺酶標(biāo)記物（Rac-HRP），游離的萊克多巴胺（Rac）與萊克多巴胺酶標(biāo)記物（Rac-HRP）競爭萊克多巴胺抗體結(jié)合位點。經(jīng)過孵育及洗板后，加入底物并孵育。結(jié)合的酶連接物將底物轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)終止液后使顏色由藍(lán)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450 nm 處測量，吸光度值與樣品中的萊克多巴胺濃度成反比，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣品中萊克多巴胺的含量。

四、檢測限

檢測限：0.05ng/ml（0.05ppb）

五、特異性

     交叉物                            交叉率（%）

Dobutamine……………………………………5.3

Ritodrine………………………………………3.6

Ractopamine Gluc.A…………………………1.0

Ractopamine Gluc B……………………………384

(1S,3S) –Ractopamine…………………………2.1

(1R,3S)-Ractopamine……………………………0.9

Isoxsuprine………………………………………0.3

Salmeterol…………………………………………0.3

Fenoterol…………………………………………0.1       

Clenbuterol……………………………………<0.01

Salbutamol………………………………………<0.01

六、試劑盒組成

每一個盒中的試劑足夠進(jìn)行 96 個試驗（包括標(biāo)準(zhǔn)測定），試劑盒中的組份如下：

1、96孔酶標(biāo)板1塊（12孔×8條）：預(yù)包被羊抗鼠IgG

2、標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶（1ml/瓶）：

0ng/mL、0.1ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.1ng/mL

3、酶連接物（6mL）：辣根過氧化物酶標(biāo)記的萊克多巴胺工作液

4、萊克多巴胺抗體（6mL）：鼠抗萊克多巴胺單克隆抗體工作液

5、底物液A（6mL）：過氧化脲

6、底物液B（6mL）：四甲基聯(lián)*（TMB）

7、終止液（6mL）：2N H₂SO₄

8、濃縮洗滌液（25×）（25mL）：含Tween-20的磷酸鹽緩沖液（PBST）

9、其他：封板膜3張，自封袋1個，說明書1份

七、樣本處理

處理任何樣本，必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。取50μL清亮尿樣直接測定，如尿樣渾濁3000轉(zhuǎn)離心10min，取上層清亮尿液測定，暫不使用的樣本應(yīng)于-20℃冷凍保存。

八、檢測步驟

仔細(xì)的洗滌非常重要。避免在操作過程中微孔出現(xiàn)干燥。

1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20-25℃）平衡30min以上。

2、準(zhǔn)備：取出需要數(shù)量的微孔板，將用剩的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。將微孔板條插入微孔架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個平行實驗，記錄下標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置。

3、加抗體：每孔加入100μL稀釋后的抗體溶液，37℃恒溫箱孵育30分鐘。

4、洗板：倒出孔中的液體，將微孔架倒置在干凈吸水紙上拍打，以保證*除去孔中的液體。每孔加滿稀釋后的洗滌工作液，靜置20秒鐘，甩去液體，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次。

5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品：加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品到各自的微孔中，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個平行實驗，然后加入50μL稀釋后的酶連接物到微孔，小心地充分混合，37℃恒溫箱孵育30分鐘。

6、重復(fù)3的操作。

7、顯色：每孔先加入底物液A 50μL，再加入底物液B 50μL，37℃避光孵育15min（如果顯色過淺，可適當(dāng)延長孵育時間，反之亦然）。

8、測定：每孔加入終止液50μL，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處，測定每孔OD值。

九、結(jié)果判定

（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以*，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中萊克多巴胺的實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（索?。?/span>

十、注意事項

1、嚴(yán)格按照說明書操作時間，每加一種試劑前需要將其搖勻，各操作步驟緊湊進(jìn)行。

2、室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

3、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

4、試劑變質(zhì)的跡象

底物有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

6、在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色20min即可。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時間到25min（或更長），但不得超過30min。反之，則減短反應(yīng)時間。

7、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

十一、貯存條件及有效期

貯存條件：2-8℃、干燥避光防潮。

有效期：在正確貯存條件下，有效期為12個月。