克倫特羅（Clenbuterol）定量檢測(cè)試劑盒（ELISA）

使用說(shuō)明書(shū)

一、概要

克侖特羅（Clenbuterol）屬于β-興奮劑，是一種高選擇性的興奮劑和激素，具有水解脂肪、合成代謝和對(duì)非條紋肌肉組織的松弛作用。近年來(lái)被非法添加到飼料中以提高脂肪型動(dòng)物的瘦肉率和加速動(dòng)物生長(zhǎng)，因其添加劑量是治療劑量的5-10倍，以至于在動(dòng)物體內(nèi)殘留而給消費(fèi)者帶來(lái)危害。

通常情況下，HPLC或GC-MS是克倫特羅殘留檢測(cè)的確證方法，但是其前處理步驟繁瑣、費(fèi)用昂貴。酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)試劑盒具有成本低廉、操作簡(jiǎn)便、一次處理樣本量大等優(yōu)點(diǎn)，已成為常規(guī)的初步篩查方法。本試劑盒是應(yīng)用ELISA技術(shù)研發(fā)的新一代藥物殘留檢測(cè)產(chǎn)品，與儀器分析技術(shù)相比具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和靈敏度高等特點(diǎn)，能zui大限度地減少操作誤差和工作強(qiáng)度。

二、用途

定量檢測(cè)動(dòng)物尿液中克侖特羅（Clenbuterol）的殘留。

三、檢測(cè)原理

本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫試驗(yàn)。檢測(cè)的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)，微孔板預(yù)包被羊抗鼠IgG捕獲抗體，加入鼠抗克倫特羅抗體后，會(huì)與捕獲抗體連接。經(jīng)過(guò)孵育及洗板后，加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品及克倫特羅酶標(biāo)記物（Clen-HRP），游離的克倫特羅（Clen）與克倫特羅酶標(biāo)記物（Clen-HRP）競(jìng)爭(zhēng)克倫特羅抗體結(jié)合位點(diǎn)。經(jīng)過(guò)孵育及洗板后，加入底物并孵育。結(jié)合的酶連接物將底物轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)終止液后使顏色由藍(lán)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450 nm 處測(cè)量，吸光度值與樣品中的克倫特羅濃度成反比，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣品中克侖特羅的含量。

四、檢測(cè)限

檢測(cè)限：0.03ng/ml（0.03ppb）

五、特異性

克侖特羅 ……………………………………………*

* …………………………………………約10%

他林 …………………………………………小于10%

非諾特羅 ……………………………………………小于1%

馬布特羅 ……………………………………………約30%

西馬特羅 ……………………………………………小于1%

溴布特羅 ……………………………………………約92%

塞曼特羅 ……………………………………………小于1%

異丙腎上腺素 ………………………………………小于1%

六、試劑盒組成

每一個(gè)盒中的試劑足夠進(jìn)行 96 個(gè)試驗(yàn)（包括標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定），試劑盒中的組份如下：

1、96孔酶標(biāo)板1塊（12孔×8條）：預(yù)包被羊抗鼠IgG

2、標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶（1ml/瓶）：

0ng/mL、0.03ng/mL、0.1ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL

3、酶標(biāo)記物（6mL）：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的克倫特羅工作液

4、克倫特羅抗體（10mL）：鼠抗克倫特羅單克隆抗體工作液

5、底物液A（6mL）：過(guò)氧化脲

6、底物液B（6mL）：四甲基聯(lián)*（TMB）

7、終止液（6mL）：2N H₂SO₄

8、濃縮洗滌液（20×）（25mL）：含Tween-20的磷酸鹽緩沖液（PBST）

9、其他：封板膜3張，自封袋1個(gè)，說(shuō)明書(shū)1份

七、樣本處理

處理任何樣本，必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。取50μL清亮尿樣直接測(cè)定，如尿樣渾濁3000轉(zhuǎn)離心10min，取上層清亮尿液測(cè)定，暫不使用的樣本應(yīng)于-20℃冷凍保存。

八、檢測(cè)步驟

仔細(xì)的洗滌非常重要。避免在操作過(guò)程中微孔出現(xiàn)干燥。

1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20-25℃）平衡30min以上。

2、準(zhǔn)備：取出需要數(shù)量的微孔板，將用剩的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。將微孔板條插入微孔架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄下標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置。

3、加抗體：每孔加入100μL抗體溶液，37℃恒溫箱孵育30分鐘。

4、洗板：倒出孔中的液體，將微孔架倒置在干凈吸水紙上拍打，以保證*除去孔中的液體。每孔加滿(mǎn)稀釋后的洗滌工作液，靜置20秒鐘，甩去液體，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次。

5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品：加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品到各自的微孔中，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，然后加入50μL酶標(biāo)記物到微孔，小心地充分混合，37℃恒溫箱孵育30分鐘。

6、重復(fù)3的操作。

7、顯色：每孔先加入底物液A 50μL，再加入底物液B 50μL，37℃避光孵育15min（如果顯色過(guò)淺，可適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間，反之亦然）。

8、測(cè)定：每孔加入終止液50μL，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處，測(cè)定每孔OD值。

九、結(jié)果判定

（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以*，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中克侖特羅的實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專(zhuān)業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（索?。?/span>

十、注意事項(xiàng)

1、嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作時(shí)間，每加一種試劑前需要將其搖勻，各操作步驟緊湊進(jìn)行。

2、室溫低于20℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

3、在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)不成線(xiàn)性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

4、試劑變質(zhì)的跡象

底物有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

5、不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒；也不要使用過(guò)了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過(guò)了有效期的試劑盒會(huì)引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。

6、在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色15min即可。若顏色較淺，可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到25min（或更長(zhǎng)），但不得超過(guò)30min。反之，則減短反應(yīng)時(shí)間。

7、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

十一、貯存條件及有效期

貯存條件：2-8℃、干燥避光防潮。

有效期：在正確貯存條件下，有效期為12個(gè)月。