在臨床檢驗中，此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如 HBsAg 、HBeAg、AFP、hCG 等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。
如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結合物。
這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步檢測。
在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成 "夾心復合物"。類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現(xiàn)象，此時反應后顯色的吸光值（位于抗原過剩帶上）與標準曲線（位于抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，所得結果將低于實際的含量，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應（hook effect），因為標準曲線到達高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結果。
因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中 HBsAg 、AFP 和尿液hCG等）時，應注意可測范圍的zui高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。
假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg 的a 決定簇，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在 HBsAg 的檢測中應注意亞型問題，HBs Ag有adr、adw、ayr 、ayw4個亞型，雖然每種亞型均有相同的 a決定簇的反應性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。
