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上海哈靈生物科技有限公司
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體外非細胞系統(tǒng)CYP3A4活性熒光定量檢測試劑盒說明書
2026-5-22 閱讀(6)
備注說明：本文件為語燕生物內(nèi)部精簡版使用說明書，如需完整版操作規(guī)范、詳細參數(shù)配比、數(shù)據(jù)分析方案及相關(guān)技術(shù)咨詢，可聯(lián)系語燕生物技術(shù)人員申領(lǐng)。
一、主要用途（貨號：HL18027.2 v.A）
本試劑盒由語燕生物優(yōu)化改良配方與檢測體系，依托經(jīng)典BFCD顯色反應(yīng)原理，搭配NADPH再生體系，通過監(jiān)測底物芐氧基三氟甲基代謝轉(zhuǎn)化為羥基三氟甲基（HFC）后的熒光信號波動，實現(xiàn)對CYP3A4酶活性的定量檢測。本產(chǎn)品適用于血清、血漿、組織純化微粒體、重組CYP3A4純酶等多種實驗樣本的酶活分析，試劑開蓋即可使用，操作流程簡便，體系穩(wěn)定性良好，可滿足常規(guī)科研場景下CYP3A4酶活性的檢測需求。
二、技術(shù)背景
細胞色素P450是生物體內(nèi)重要的微粒體多功能氧化酶系，包含五十余種功能亞型，廣泛參與機體內(nèi)外源物質(zhì)代謝過程。其中CYP3A4亞型在人體肝臟及腸道中表達占比較高，分別占據(jù)肝臟P450總含量的30%、腸道P450總含量的70%，參與臨床上超60%藥物的氧化、羥化代謝過程，是藥物代謝機制研究、毒理學風險評估的核心研究靶點，人源CYP3A4與小鼠CYP3A11亞型功能具有同源對應(yīng)性。
語燕生物搭建成熟的BFCD特異性檢測體系，以芐氧基三氟甲基為CYP3A4特異性底物，在NADPH再生體系的協(xié)同作用下，依托CYP3A4的酶促反應(yīng)完成底物代謝，生成具備特異性熒光特性的HFC產(chǎn)物。通過采集410nm激發(fā)波長、538nm發(fā)射波長下的熒光信號強度，可精準量化樣本中的CYP3A4酶活性，體系特異性適配CYP3A4酶活檢測的科研實驗要求。
三、試劑盒組分
本試劑盒所有組分均由語燕生物標準化工藝配比制備，各試劑組分搭配完整、體系配比均勻，可直接配套用于整套實驗流程，具體組分如下：
緩沖液（Reagent A）：若干毫升
反應(yīng)液（Reagent B）：若干微升
底物液（Reagent C）：若干微升
終止液（Reagent D）：若干毫升
標準液（Reagent E）：若干微升
語燕生物產(chǎn)品說明書：1份
四、保存條件與有效期
本試劑盒需統(tǒng)一存放于-20℃低溫環(huán)境避光密封保存，其中反應(yīng)液、底物液、標準液對光照及溫度波動敏感，需重點避光防護，同時全程避免反復(fù)凍融，防止有效成分失效。在規(guī)范儲存條件下，語燕生物保障試劑盒有效使用周期為6個月。
五、用戶自備器材與設(shè)備
為適配語燕生物本試劑盒的檢測體系，保障實驗數(shù)據(jù)穩(wěn)定性與重復(fù)性，實驗前需提前備好以下常規(guī)實驗器材與儀器：
1.5mL離心管：用于標準品稀釋、樣本配制與反應(yīng)體系搭建
恒溫培養(yǎng)箱：用于實驗體系37℃恒定溫度孵育反應(yīng)
200μL 1cm光徑比色皿/黑色96孔板：用于熒光信號采集的承載容器
熒光分光光度儀/熒光酶標儀：用于檢測體系熒光信號強度
六、實驗操作步驟（精簡版）
實驗正式開始前，將凍存于-20℃的試劑盒全部試劑轉(zhuǎn)移至冰槽低溫融化，全程避光操作，嚴格遵循語燕生物標準化實驗流程開展操作，避免環(huán)境因素干擾實驗結(jié)果。
（一）測定準備
1、提前備好微粒體、純酶、體液等待測樣本，全程冰上低溫放置，保證樣本澄清無沉淀、無雜質(zhì)污染；
2、提前調(diào)試熒光檢測儀器，設(shè)定恒溫37℃，激發(fā)波長410±20nm、發(fā)射波長530±25nm，開機預(yù)熱并完成儀器調(diào)零；
3、準備5支潔凈1.5mL離心管，依次標記1-5號，向各管分別加入定量Reagent A緩沖液；
4、梯度配制標準體系：1號管加入原標準液，逐級稀釋至4號管，5號管不添加標準液，作為實驗空白對照；
5、配制完成的標準管統(tǒng)一置于冰槽避光存放，備用。
（二）標準曲線測定
1、取離心管，依次加入定量緩沖液、反應(yīng)液、4μL底物液及20μL不同濃度梯度的標準工作液；
2、體系混勻后，于37℃避光條件下孵育30min，針對低活性酶樣本可延長孵育時長至45min；
3、孵育結(jié)束后加入定量終止液充分混勻，終止酶促反應(yīng)，將體系轉(zhuǎn)移至檢測載體；
4、立即上機檢測，讀取各體系相對熒光單位（RFU），扣除5號空白管熒光數(shù)值，得到各濃度標準品的實際熒光強度；
5、以HFC標準濃度為橫坐標（X軸）、校正后的實際熒光強度為縱坐標（Y軸），繪制線性標準曲線，如需專業(yè)擬合方法可咨詢語燕生物技術(shù)人員。
（三）樣品活性測定
1、取潔凈離心管，依次加入定量緩沖液、反應(yīng)液、底物液，再加入20μL澄清無雜質(zhì)的待測樣本；
2、充分混勻體系后，37℃避光孵育30min，樣本酶活性偏低時可調(diào)整孵育時長至45min；
3、孵育完成后加入終止液混勻終止反應(yīng)，上機檢測獲取樣本熒光值，扣除空白對照背景熒光；
4、結(jié)合預(yù)先繪制的標準曲線，換算出待測樣本對應(yīng)的HFC濃度，用于后續(xù)酶活性計算。
（四）活性計算
本實驗酶活統(tǒng)計標準由語燕生物統(tǒng)一規(guī)范：在37℃、pH7.5的標準反應(yīng)條件下，每分鐘催化生成1nmol羥基三氟甲基（HFC）所需的CYP3A4酶量，定義為1個CYP3A4酶活性單位。完整計算公式與數(shù)據(jù)換算模板，可聯(lián)系語燕生物技術(shù)團隊獲取。
七、關(guān)鍵注意事項
1、本試劑盒整體可完成25次獨立檢測，檢測次數(shù)包含標準曲線組別，可滿足常規(guī)批量樣本實驗需求；
2、全程實驗操作需佩戴防護手套，單次實驗流程中標準曲線僅需測定一次，無需重復(fù)配制檢測；
3、待測樣本澄清度直接影響熒光檢測精度，渾濁樣本易造成數(shù)據(jù)偏差，樣本預(yù)處理可選用語燕生物細胞可溶性總蛋白質(zhì)制備試劑盒（30002.1）；
4、若預(yù)實驗檢測酶活性數(shù)值偏低，可在37℃恒溫條件下延長孵育時間至45分鐘，提升反應(yīng)產(chǎn)物積累量；
5、單批次實驗結(jié)束后，需及時清洗比色皿，避免殘留反應(yīng)液殘留，影響后續(xù)檢測實驗數(shù)據(jù)；
6、不同類型待測樣本需匹配對應(yīng)蛋白濃度標準：血清樣本100微克/20微升、微粒體樣本20微克/20微升、純酶蛋白樣本10微克/20微升；可使用語燕生物Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒（30030.1）完成蛋白定量標定；
7、待測樣本熒光數(shù)值超出標準曲線線性范圍時，可通過濃縮或稀釋樣本體系調(diào)整濃度后重新檢測；
8、實驗可選用CYP3A4特異性抑制劑（CISAPRIDE，IC50＝60納摩爾）設(shè)置抑制對照或陰性對照，有效提升實驗數(shù)據(jù)的嚴謹性與可信度；
9、CYP3A4酶活性單位統(tǒng)一界定標準：37℃、pH 7.5反應(yīng)條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化1納摩爾芐氧基三氟甲基生成羥基三氟甲基所需的酶量，即為單一酶活性單位；
10、語燕生物可配套提供各類毒理學、藥物代謝相關(guān)檢測試劑，可根據(jù)實驗需求搭配拓展使用。
以上說明書為簡版 僅供參考
